Jakościowe i ilościowe oznaczanie białka w moczu. Norma „Oznaczanie białka w moczu metodą ekspresową”

U zdrowych osób w dobowym moczu stwierdza się niewielkie ilości białka. Tak małych stężeń nie da się jednak wykryć konwencjonalnymi metodami badawczymi. Uwolnienie większych ilości białka, przy którym zwykłe testy jakościowe na obecność białka w moczu dają wynik dodatni, nazywa się białkomoczem. Wyróżnia się białkomocz nerkowy (prawdziwy) i pozanerkowy (fałszywy). W przypadku białkomoczu nerkowego białko przedostaje się do moczu bezpośrednio z krwi w wyniku zwiększonej filtracji przez kłębuszki nerkowe lub zmniejszonej resorpcji zwrotnej w kanalikach.

Białkomocz nerkowy (prawdziwy).

Białkomocz fizjologiczny u noworodków, który zanika 4–10 dnia po urodzeniu, a u wcześniaków nieco później;
- albuminuria ortostatyczna, która jest typowa dla dzieci w wieku 7-18 lat i pojawia się tylko w pozycji pionowej ciała;
- przejściowa (udarowa) albuminuria, której przyczyną mogą być różne choroby układu pokarmowego, ciężka anemia, oparzenia, urazy lub czynniki fizjologiczne: duża aktywność fizyczna, hipotermia, silne emocje, obfite, bogate w białko jedzenie itp.

Organiczny (nerkowy) białkomocz obserwuje się z powodu przejścia białka z krwi przez uszkodzone obszary śródbłonka kłębuszków nerkowych w chorobach nerek (kłębuszkowe zapalenie nerek, nerczyca, stwardnienie nerek, amyloidoza, nefropatia kobiet w ciąży), zaburzenia hemodynamiki nerek (nerkowe nadciśnienie żylne, niedotlenienie), działanie troficzne i toksyczne (w tym lecznicze) na ściany naczyń włosowatych kłębuszków nerkowych.

Pozanerkowy (fałszywy) białkomocz

Oznaczanie białka w moczu

Wśród jakościowych metod oznaczania bek w moczu najczęściej stosowane są ujednolicony test z kwasem sulfosalicylowym i próba pierścieniowa Hellera.

Standaryzowany test z kwasem sulfasalicylowym przeprowadza się w następujący sposób. Do 2 probówek wlewa się 3 ml przefiltrowanego moczu. Do jednego z nich dodaje się 6-8 kropli 20% roztworu kwasu sulfasalicylowego. Obie probówki porównuje się na ciemnym tle. Mętny mocz w probówce zawierającej kwas sulfasalicylowy wskazuje na obecność białka. Przed badaniem należy określić odczyn moczu, a jeśli jest zasadowy, zakwasić go 2-3 kroplami 10% roztworu kwasu octowego.

Test Hellera polega na tym, że w obecności białka w moczu na granicy kwasu azotowego i moczu następuje krzepnięcie i pojawia się biały pierścień. Do probówki wlewa się 1-2 ml 30% roztworu kwasu azotowego i dokładnie taką samą ilość przefiltrowanego moczu ostrożnie rozprowadza się wzdłuż ścianek probówki. Pojawienie się białego pierścienia na granicy dwóch płynów wskazuje na obecność białka w moczu. Należy pamiętać, że czasami w obecności dużej ilości moczanów tworzy się biały pierścień, jednak w odróżnieniu od pierścienia białkowego pojawia się on nieco powyżej granicy pomiędzy dwiema cieczami i rozpuszcza się po podgrzaniu [Pletneva N.G., 1987].

Do najczęściej stosowanych metod ilościowych należą:

1) ujednolicona metoda Brandberga-Robertsa-Stolnikowa oparta na teście pierścieniowym Hellera;
2) fotoelektrokolorymetryczna metoda ilościowego oznaczania białka w moczu na podstawie zmętnienia powstałego po dodaniu kwasu sulfasalicylowego;
3) metoda biuretowa.

Wykrywanie białka w moczu metodą uproszczoną, przyspieszoną przeprowadza się metodą kolorymetryczną z wykorzystaniem papierków wskaźnikowych firm Lachema (Słowacja), Albuphan, Ames (Anglia), Albustix, Boehringer (Niemcy), Comburtest itp. Metoda polega na zanurzeniu specjalny pasek papieru nasączony w moczu błękitem tetrabromofenolowym i buforem cytrynianowym, który zmienia kolor z żółtego na niebieski w zależności od zawartości białka w moczu. Przybliżone stężenie białka w moczu testowym określa się za pomocą standardowej skali. Aby uzyskać prawidłowe wyniki należy spełnić poniższe warunki. pH moczu powinno mieścić się w przedziale 3,0-3,5; mocz zbyt zasadowy (pH 6,5) da wynik fałszywie dodatni, a mocz zbyt kwaśny (pH 3,0) da wynik fałszywie ujemny.

Papierek powinien mieć kontakt z badanym moczem nie dłużej niż jest to wskazane w instrukcji, w przeciwnym razie test da fałszywie dodatni wynik. To ostatnie obserwuje się również, gdy w moczu znajduje się duża ilość śluzu. Czułość różnych rodzajów i partii papieru może być różna, dlatego też do oznaczania ilościowego białka w moczu tą metodą należy zachować ostrożność. Określenie jego ilości w moczu dobowym za pomocą papierka wskaźnikowego nie jest możliwe [Pletneva N.G., 1987]

Oznaczanie dziennego białkomoczu

Metodologia. Do probówki wlewa się 5-10 ml dokładnie wymieszanego dziennego moczu i wzdłuż jej ścianek ostrożnie dodaje się 30% roztwór kwasu azotowego. Jeśli w moczu znajduje się białko w ilości 0,033% (tj. 33 mg na 1 litr moczu), po 2-3 minutach pojawia się cienki, ale wyraźnie widoczny biały pierścień. Przy niższym stężeniu próbka jest ujemna. Jeżeli w moczu występuje większa zawartość białka, jego ilość określa się poprzez wielokrotne rozcieńczanie moczu wodą destylowaną, aż do momentu, w którym przestanie tworzyć się pierścień. W ostatniej probówce, w której pierścień jest nadal widoczny, stężenie białka wyniesie 0,033%. Mnożąc 0,033 przez stopień rozcieńczenia moczu, zawartość białka w 1 litrze nierozcieńczonego moczu określa się w gramach. Następnie zawartość białka w dobowym moczu oblicza się ze wzoru:

K=(x V)/1000

Gdzie K to ilość białka w dobowym moczu (g); x - ilość białka w 1 litrze moczu (g); V to ilość wydalanego moczu na dzień (ml).

Zwykle w ciągu dnia z moczem wydalane jest od 27 do 150 mg (średnio 40-80 mg) białka.

Test ten pozwala na oznaczenie w moczu jedynie drobno zdyspergowanych białek (albuminy). Dokładniejsze metody ilościowe (metoda kolorymetryczna Kjeldahla itp.) są dość złożone i wymagają specjalnego sprzętu.

W przypadku białkomoczu nerek z moczem wydalane są nie tylko albuminy, ale także inne rodzaje białek. Normalny proteinogram (według Seitza i in., 1953) ma następujący procent: albumina - 20%, α 1 -globulina - 12%, α 2 -globulina - 17%, γ-globulina - 43% i β-globulina - 8% . Stosunek albumin do globulin zmienia się w różnych chorobach nerek, m.in. stosunek ilościowy pomiędzy frakcjami białkowymi zostaje zakłócony.

Do najczęściej stosowanych metod frakcjonowania uroprotein zalicza się: wysalanie solami obojętnymi, frakcjonowanie elektroforetyczne, metody immunologiczne (reakcja promieniowej immunodyfuzji Manciniego, analiza immunoelektroforetyczna, immunoelektroforeza strącaniowa), chromatografia, filtracja żelowa i ultrawirowanie.

W związku z wprowadzeniem metod frakcjonowania uroprotein opartych na badaniu ruchliwości elektroforetycznej, zmienności masy cząsteczkowej, wielkości i kształtu cząsteczek uroprotein, możliwe stało się rozpoznanie rodzajów białkomoczu charakterystycznych dla danej choroby oraz badanie klirensu poszczególnych osoczy białka. Do chwili obecnej w moczu zidentyfikowano ponad 40 białek osocza, w tym 31 białek osocza w moczu prawidłowym.

Selektywny białkomocz

Wykrycie w moczu białek o stosunkowo dużej masie cząsteczkowej wskazuje na brak selektywności filtra nerkowego i jego poważne uszkodzenie. W tych przypadkach mówią o niskiej selektywności białkomoczu. Dlatego powszechne jest oznaczanie frakcji białkowych w moczu metodami elektroforezy skrobiowej i żelu poliakryloamidowego. Na podstawie wyników tych metod badawczych można ocenić selektywność białkomoczu.

Według V.S. Makhliny (1975) najbardziej uzasadnione jest określenie selektywności białkomoczu poprzez porównanie klirensu 6-7 poszczególnych białek osocza krwi (albumina, traneferyna, α 2 - makroglobulina, IgA, IgG, IgM) przy użyciu dokładnych i specyficznych ilościowe metody immunologiczne reakcji promieniowej immunodyfuzji według Manciniego, analiza immunoelektroforetyczna i immunoelektroforeza strącana. Stopień selektywności białkomoczu określa się za pomocą wskaźnika selektywności, czyli stosunku białek porównywanych i referencyjnych (albuminy).

Badanie klirensów poszczególnych białek osocza pozwala uzyskać wiarygodną informację o stanie błon podstawnych filtracyjnych kłębuszków nerkowych. Związek między naturą białek wydalanych z moczem a zmianami w błonach podstawnych kłębuszków nerkowych jest na tyle wyraźny i stały, że uroproteinogram może pośrednio ocenić zmiany patofizjologiczne w kłębuszkach nerkowych. Zwykle średnia wielkość porów błony podstawnej kłębuszków wynosi 2,9-4 A° NM, co umożliwia przejście białek o masie cząsteczkowej do 10 4 (mioglobulina, kwaśna α 1 - glikoproteina, łańcuchy lekkie immunoglobulin, Fc i fragmenty Fab IgG, albuminy i transferyny).

W przypadku kłębuszkowego zapalenia nerek i zespołu nerczycowego zwiększa się wielkość porów w błonach podstawnych kłębuszków, w związku z czym błona podstawna staje się przepuszczalna dla cząsteczek białka o dużych rozmiarach i masie (ceruloplazmina, haptoglobina, IgG, IgA itp.). Przy ekstremalnym uszkodzeniu kłębuszków nerkowych w moczu pojawiają się gigantyczne cząsteczki białek osocza krwi (α 2 -makroglobulina, IgM i β 2 -lipoproteina).

Określając spektrum białek w moczu, można stwierdzić, że dotknięte są głównie niektóre obszary nefronu. Kłębuszkowe zapalenie nerek z dominującym uszkodzeniem błon podstawnych kłębuszków charakteryzuje się obecnością w moczu białek o dużej i średniej masie cząsteczkowej. Odmiedniczkowe zapalenie nerek z dominującym uszkodzeniem błon podstawnych kanalików charakteryzuje się brakiem białek wielkocząsteczkowych i obecnością zwiększonej ilości białek średnio- i niskocząsteczkowych.

β 2 -Mikroglobulina

Stężenie tego białka w osoczu krwi i moczu oznacza się metodą radioimmunologiczną przy użyciu standardowego zestawu „Phade-bas β 2 -mikroiest” (Pharmacia, Szwecja). Surowica krwi osób zdrowych zawiera średnio 1,7 mg/l (zakres od 0,6 do 3 mg/l), a mocz zawiera średnio 81 μg/l (maksymalnie 250 μg/l) β 2 -mikroglobuliny. Jej przekroczenie w moczu powyżej 1000 mcg/l jest zjawiskiem patologicznym. Zawartość β 2 -mikroglobuliny we krwi wzrasta w chorobach, którym towarzyszy upośledzona filtracja kłębuszkowa, zwłaszcza w ostrym i przewlekłym kłębuszkowym zapaleniu nerek, wielotorbielowatości nerek, stwardnieniu nerek, nefropatii cukrzycowej, ostrej niewydolności nerek.

Stężenie β 2 -mikroglobuliny w moczu wzrasta w chorobach, którym towarzyszy upośledzona funkcja resorpcji kanalików, co prowadzi do zwiększenia jej wydalania z moczem 10-50 razy, w szczególności z odmiedniczkowym zapaleniem nerek, przewlekłą niewydolnością nerek, ropną zatrucie itp. Charakterystyczne jest, że w przypadku zapalenia pęcherza moczowego w przeciwieństwie do odmiedniczkowego zapalenia nerek nie zwiększa się stężenie β 2 -mikroglobuliny w moczu, co można wykorzystać w diagnostyce różnicowej tych chorób. Jednak interpretując wyniki badania, należy wziąć pod uwagę, że każdemu wzrostowi temperatury zawsze towarzyszy zwiększenie wydalania β 2 -mikroglobuliny z moczem.

Średnie cząsteczki krwi i moczu

Poziom SM we krwi i moczu oznacza się za pomocą badania przesiewowego, a także spektrofotometrii w strefie ultrafioletu przy długości fali 254 i 280 mm na spektrofotometrze DI-8B oraz spektrofotometrii dynamicznej z przetwarzaniem komputerowym w zakresie długości fal 220-335 nm na tym samym spektrometrze firmy Beckman. Zawartość SM we krwi przyjmuje się jako normę równą 0,24 ± 0,02 arb. jednostek iw moczu - 0,312 ± 0,09 arb. jednostki
Będąc normalnymi odpadami organizmu, są zwykle usuwane z niego w nocy poprzez filtrację kłębuszkową o 0,5%; 5% z nich jest utylizowanych w inny sposób. Wszystkie frakcje SM ulegają resorpcji rurowej.

Uroproteiny nieosoczowe (tkankowe).

Białka tkankowe w moczu wykrywa się za pomocą konwencjonalnych metod chemii białek (ultrawirowanie, chromatografia żelowa, różne rodzaje elektroforezy), specyficznych reakcji na enzymy i hormony oraz metod immunologicznych. Te ostatnie umożliwiają również określenie stężenia uroprotein nieosoczowych w moczu, a w niektórych przypadkach określenie struktur tkankowych, które stały się źródłem jego pojawienia się. Główną metodą wykrywania białek innych niż osocze w moczu jest analiza immunodyfuzyjna z surowicą odpornościową uzyskaną w wyniku immunizacji zwierząt doświadczalnych ludzkim moczem, a następnie zubożonym (adsorbowanym) przez białka osocza krwi.

Badanie enzymów we krwi i moczu

Komórki kanalików nerkowych, zwłaszcza części proksymalnych, zawierają maksymalną ilość enzymów. Ich wysoką aktywność obserwuje się w pętli Henlego, kanalikach prostych i kanalikach zbiorczych. Zmiany aktywności poszczególnych enzymów w różnych chorobach nerek zależą od charakteru, nasilenia i lokalizacji procesu. Obserwuje się je przed pojawieniem się zmian morfologicznych w nerkach. Ponieważ zawartość różnych enzymów jest wyraźnie zlokalizowana w nefronie, oznaczenie jednego lub drugiego enzymu w moczu może przyczynić się do miejscowej diagnostyki procesu patologicznego w nerkach (kłębuszki, kanaliki, kora lub rdzeń), diagnostyki różnicowej choroby nerek i określenie dynamiki (osłabienie i zaostrzenie) procesu w miąższu nerek.

W diagnostyce różnicowej chorób układu moczowo-płciowego oznacza się aktywność następujących enzymów we krwi i moczu: dehydrogenazy mleczanowej (LDH), aminopeptydazy leucynowej (LAP), fosfatazy kwaśnej (AP), fosfatazy zasadowej (ALP), β -glukuronidaza, transaminaza glutamino-oksalooctowa (GAST), aldolaza, transamidynaza itp. Aktywność enzymów w surowicy krwi i moczu oznacza się metodami biochemicznymi, spektrofotometrycznymi, chromatograficznymi, fluorymetrycznymi i chemiluminescencyjnymi.

Enzymuria w chorobach nerek jest bardziej wyraźna i naturalna niż enzymemia. Jest to szczególnie widoczne w ostrej fazie choroby (ostre odmiedniczkowe zapalenie nerek, uraz, rozpad guza, zawał nerek itp.). W chorobach tych stwierdza się wysoką aktywność transamidynazy, LDH, ALP i CP, hialuronidazy, LAP, a także takich niespecyficznych enzymów jak GSH, katalaza [Polyantseva L.R., 1972].

Selektywna lokalizacja enzymów w nefronie po wykryciu w moczu PAP i fosfatazy zasadowej pozwala z całą pewnością mówić o ostrych i przewlekłych chorobach nerek (ostra niewydolność nerek, martwica kanalików nerkowych, przewlekłe kłębuszkowe zapalenie nerek) [Shemetov V.D., 1968]. Według A.A. Karelina i L.R. Polyantsevy (1965) transamidynaza występuje tylko w dwóch narządach - nerkach i trzustce. Jest to enzym mitochondrialny nerek, zwykle nieobecny we krwi i moczu. W różnych chorobach nerek transamidynaza pojawia się we krwi i moczu, a w przypadku uszkodzenia trzustki - tylko we krwi.

Krotkiewski (1963) uważa aktywność fosfatazy zasadowej w moczu za test różnicowy w diagnostyce kłębuszkowego zapalenia nerek i odmiedniczkowego zapalenia nerek, którego wzrost jest bardziej charakterystyczny dla odmiedniczkowego zapalenia nerek i cukrzycowego stwardnienia kłębuszków nerkowych niż ostrego i przewlekłego zapalenia nerek. Narastająca dynamika amylazemii przy jednoczesnym zmniejszeniu amylazurii może wskazywać na stwardnienie nerek i kurczenie się nerek; PAP ma największe znaczenie w zmianach patologicznych w kłębuszkach i kanalikach krętych nerki, ponieważ jego zawartość w tych częściach nefronu jest większa [Shepotinovsky wiceprezes i in., 1980]. Aby zdiagnozować toczniowe zapalenie nerek, zaleca się oznaczenie β-glukuronidazy i CP [Privalenko M.N. i in., 1974].

Oceniając rolę enzymurii w diagnostyce chorób nerek, należy wziąć pod uwagę następujące kwestie. Enzymy, będące w przyrodzie białkami, o niskiej masie cząsteczkowej, mogą przechodzić przez nienaruszone kłębuszki, warunkując tzw. enzymurię fizjologiczną. Wśród tych enzymów stale wykrywa się w moczu α-amylazę (względna masa cząsteczkowa 45 000) i uropepsynę (względna masa cząsteczkowa 38 000).

Oprócz enzymów drobnocząsteczkowych w moczu zdrowych osób w małych stężeniach można znaleźć inne enzymy: LDH, aminotransferazy asparaginianowe i alaninowe, ALP i CP, maltazę, aldolazę, lipazę, różne proteazy i peptydazy, sulfatazę, katalazę, rybonukleaza, peroksydaza.

Enzymy o dużej masie cząsteczkowej, o względnej masie cząsteczkowej większej niż 70 000-100 000, według Richtericha (1958) i Hessa (1962), mogą przenikać do moczu tylko wtedy, gdy upośledzona jest przepuszczalność filtra kłębuszkowego. Normalna zawartość enzymów w moczu nie pozwala wykluczyć procesu patologicznego w nerkach z powodu niedrożności moczowodu. W przypadku epzymurii enzymy mogą być uwalniane nie tylko z samych nerek, ale także z innych narządów miąższowych, komórek błony śluzowej dróg moczowych, gruczołu krokowego, a także powstałych elementów moczu w krwiomoczu lub leukocyturii.

Większość enzymów nie jest specyficzna dla nerek, dlatego trudno jest określić, skąd pochodzą enzymy znajdujące się w moczu osób zdrowych i chorych. Jednak stopień enzymurii, nawet w przypadku nieswoistych enzymów, w przypadku uszkodzenia nerek jest wyższy niż normalnie lub obserwowany w chorobach innych narządów. Bardziej wartościowych informacji może dostarczyć kompleksowe badanie dynamiki szeregu enzymów, zwłaszcza narządowo-specyficznych, takich jak transaminaza.

W rozwiązaniu problemu nerkowego pochodzenia enzymu w moczu pomocne jest badanie izoenzymów z identyfikacją frakcji typowych dla badanego narządu. Izoenzymy to enzymy o działaniu izogenicznym (katalizującym tę samą reakcję), ale heterogenicznymi pod względem struktury chemicznej i innych właściwości. Każda tkanka ma charakterystyczne spektrum izoenzymów. Cennymi metodami rozdzielania izoenzymów są elektroforeza na skrobi i żelu poliakryloamidowym oraz chromatografia jonowymienna.

Białko Bence'a Jonesa

Bardziej niezawodne jest wykrycie tej paraproteiny poprzez wytrącenie jej w temperaturze 40-60°C. Jednak nawet w tych warunkach wytrącanie może nie nastąpić przy zbyt kwaśnym pH (pH< 3,0—3,5) или слишком щелочной (рН >6.5) mocz, z niskim TPR i niskim stężeniem białka Bence-Jonesa. Najkorzystniejsze warunki do jego wytrącenia zapewnia metoda zaproponowana przez Patnem: 4 ml przefiltrowanego moczu miesza się z 1 ml 2 M buforu octanowego o pH 4,9 i ogrzewa przez 15 minut w łaźni wodnej o temperaturze 56°C. W obecności białka Bence Jones w ciągu pierwszych 2 minut pojawia się wyraźny osad.

Jeśli stężenie białka Bence Jones jest mniejsze niż 3 g/l, test może dać wynik negatywny, ale w praktyce zdarza się to niezwykle rzadko, gdyż jego stężenie w moczu jest zwykle większe. Nie można całkowicie polegać na testach wrzenia. Z całkowitą pewnością można go wykryć w moczu metodą immunoelektroforetyczną przy użyciu swoistych surowic przeciwko łańcuchom ciężkim i lekkim immunoglobulin.

Testy jakościowe do oznaczania białka w moczu
Zaproponowano ponad 100 reakcji do jakościowego oznaczania białka w moczu. Większość z nich opiera się na wytrącaniu białek metodami fizycznymi (ogrzewanie) lub chemicznymi. Obecność białka potwierdza pojawienie się zmętnienia.

Interesujące są także suche próbki kolorymetryczne.

Poniżej zostaną opisane jedynie najważniejsze testy praktyczne.

Próba z kwasem sulfosalicylowym. Do kilku mililitrów moczu dodać 2-4 krople 20% roztworu kwasu sulfosalicylowego. Jeśli reakcja jest pozytywna, pojawia się zmętnienie. Wynik określa się terminami: opalescencja, reakcja słabo pozytywna, pozytywna lub silnie pozytywna. Test na obecność kwasu sulfosalicylowego jest jednym z najczulszych testów wykrywających białko w moczu. Wykrywa nawet najmniejsze patologiczne wzrosty białka w moczu. Dzięki prostej technice test ten znalazł szerokie zastosowanie.

Przetestuj aseptolem. Aseptol jest substytutem kwasu sulfosalicylowego. Można go przygotować z materiałów dostępnych w każdym laboratorium (fenol i kwas siarkowy). Jako odczynnik stosuje się 20% roztwór Aseptolu. Badanie przeprowadza się w następujący sposób: do probówki zawierającej 2-3 ml moczu dodać na dno 0,5-1 ml roztworu Aseptolu. Jeśli na styku dwóch cieczy pojawi się biały pierścień skoagulowanego białka, wynik testu jest pozytywny.

Próba Hellera. Do kilku mililitrów moczu dodać 1-2 ml 30% kwasu azotowego (ciężar właściwy 1,20). Jeśli na granicy obu cieczy pojawi się biały pierścień, próbka jest dodatnia. Reakcja staje się dodatnia, jeśli zawartość białka przekracza 3,3 mg%. Czasami w obecności dużych ilości moczanu uzyskuje się biały pierścień. W przeciwieństwie do pierścienia białkowego, pierścień moczanowy nie pojawia się na granicy obu cieczy, ale nieco powyżej. Larionova sugeruje użycie 1% roztworu kwasu azotowego w nasyconym roztworze soli kuchennej jako odczynnika zamiast 30% kwasu azotowego; skutkuje to większą oszczędnością kwasu azotowego.

Przetestuj za pomocą siarczku żelaza i potasu i kwasu octowego. Reakcja ta umożliwia odróżnienie białek surowicy od albumin nukleinowych.

Do dwóch probówek wlewa się równe ilości moczu. Do jednego z nich dodaje się kilka kropli 30% roztworu kwasu octowego. Jeśli wynik jest mętny w porównaniu z probówką kontrolną, mocz zawiera albuminę nukleinową. Jeśli nie pojawi się zmętnienie, zawartość obu probówek miesza się i ponownie dzieli na dwie części. Do jednej z dwóch probówek dodaje się kilka kropli (nadmiar może zamienić wynik pozytywny na negatywny) 10% roztworu żółtej soli krwi (siarczku żelaza i potasu). W obecności białek serwatkowych uzyskuje się zmętnienie.

W przypadku zagęszczonego moczu zawierającego duże ilości kwasu moczowego i moczanów, badanie z siarczkiem żelazawo-potasowym i kwasem octowym należy wykonać po wstępnym (2-3-krotnym) rozcieńczeniu moczu wodą. W przeciwnym razie może wystąpić zmętnienie spowodowane osadzającym się kwasem moczowym.

Jest to szczególnie ważne podczas badania moczu niemowląt, który zawiera dużo kwasu moczowego i moczanów.

Z pozostałych testów jakościowych na obecność białka w moczu, opartych na wytrącaniu białek, zastosowano: test wrzenia, Esbacha, Purdy'ego, Robertsa, Almena, Balloniego, Buro, Claudiusa, Corso, Dome, Goodmann-Suzanne, Jollet, Testy Exton, Kamlet, Kobuladze, Liliendahl-Petersen, Polacci, Pons, Spiegler, Tanre, Thiele, Brown, Tsushiya itp.

Przygotowując wysokiej jakości testy na obecność białka w moczu w oparciu o wytrącanie białek, należy przestrzegać następujących ogólnych zasad, których naruszenie prowadzi do znacznych błędów w badaniu.

1. Badany mocz musi być kwaśny. W przypadku reakcji zasadowej mocz jest lekko zakwaszony kwasem octowym. Pobranie próbki z moczem o odczynie zasadowym w przypadkach, gdy jako odczynnik stosowany jest kwas, może prowadzić do jego zobojętnienia i uzyskania wyniku negatywnego, w wyniku którego uzyskana zostanie reakcja dodatnia. Dotyczy to zwłaszcza testu z kwasem sulfosalicylowym, ponieważ kwas dodaje się w bardzo małych ilościach i można go łatwo zneutralizować.

2. Badany mocz powinien być przejrzysty.

3. Próbki do oznaczania białka w moczu należy zawsze pobierać w dwóch probówkach, z których jedna pełni funkcję kontrolną. Bez probówki kontrolnej możesz nie zauważyć lekkiego zmętnienia podczas reakcji.

4. Ilość dodanego kwasu podczas badania nie powinna być zbyt duża. Duża ilość kwasu może prowadzić do powstania rozpuszczalnej kwaśnej albuminy i zamienić próbkę dodatnią w ujemną.

Kolorymetryczne próbki suche ze względu na prostą technikę zasługują na dużą uwagę. W testach tych wykorzystuje się wpływ białka na barwę wskaźnika w roztworze buforowym (tzw. błąd białkowy wskaźników). Pasek bibuły filtracyjnej nasączony kwaśnym buforem cytrynianowym i błękitem bromofenolowym jako wskaźnikiem zanurza się na krótko w moczu. Test jest pozytywny, jeśli kolor jest niebiesko-zielony. Porównując intensywność koloru ze standardami papieru kolorowego, można wyciągnąć wstępne i ilościowe wnioski. Papier wskaźnikowy sprzedawany jest w ryzach o odpowiednich standardach kolorystycznych, podobnie jak uniwersalny papier wskaźnikowy.

Metody ilościowego oznaczania białka w moczu
Zaproponowano wiele metod ilościowego oznaczania białka w moczu. Dokładne ilościowe metody oznaczania białek w materiale biologicznym nie są szeroko stosowane w oznaczaniu białka w moczu ze względu na złożone i pracochłonne techniki. Metody wolumetryczne, zwłaszcza metoda Esbacha, stały się powszechne. Są bardzo proste, ale niestety nie są zbyt dokładne. Metody grupy Brandberga-Stolnikowa są również wygodne dla kliniki, dając dokładniejsze wyniki niż metody wolumetryczne przy stosunkowo prostej technice. Jeśli posiadasz fotometr lub nefelometr, wygodne są również metody nefelometryczne.

Metoda Esbacha. Zaproponował ją paryski lekarz Esbach w 1874 roku. Mocz i odczynnik wlewa się do specjalnej probówki (albuminometr Esbacha). Probówkę zamyka się gumowym korkiem, dokładnie miesza (bez wstrząsania!) i pozostawia w pozycji pionowej do następnego dnia. Liczy się podział, do którego dochodzi kolumna osadu białkowego. Znaleziona liczba pokazuje zawartość białka. W przypadku metody Esbacha bardzo ważne jest, aby mocz był kwaśny. Zasadowy mocz może zneutralizować kwaśne składniki odczynnika i zapobiec wytrącaniu się białka.

Zalety metody: jest prosta i wygodna w praktyce.

Wady: metoda jest niedokładna, wynik uzyskuje się w ciągu 24–48 godzin.

Metoda Brandberga-Stolnikowa. Opiera się na jakościowym teście Gellera. Do oznaczania ilościowego można zastosować test Hellera, gdyż daje wynik pozytywny przy zawartości białka powyżej 3,3 mg%. Jest to maksymalne stężenie białka, poniżej którego próbka staje się ujemna.

Modyfikacja Ehrlicha i Althausena. Radzieccy naukowcy S. L. Erlikh i A. Ya. Althauzen zmodyfikowali metodę Brandberga-Stolnikowa, wskazując możliwości uproszczenia badań i oszczędności czasu w jego produkcji.

Pierwsze uproszczenie związane jest z czasem pojawienia się pierścionka. Określany jest dokładny czas jego pojawienia się, bez konieczności przestrzegania 2. i 3. minuty.

Drugie uproszczenie pozwala określić jakie rozcieńczenie należy wykonać. Autorzy wykazali, że wymagane rozcieńczenie można w przybliżeniu określić na podstawie wyglądu powstałego pierścienia. Wyróżniają się nitkowatymi, szerokimi
i kompaktowy pierścień.

Spośród metod nefelometrycznych na uwagę zasługuje Metoda Kingsberry’ego i Clarka. Do małego cylindra miarowego wlej 2,5 ml przefiltrowanego moczu i uzupełnij 3% wodnym roztworem kwasu sulfosalicylowego do objętości 10 ml. Dokładnie wymieszać i po 5 minutach dokonać fotometrii w kuwecie 1 cm przy użyciu żółtego filtra, stosując wodę jako ciecz kompensacyjną. Używając fotometru Pulfricha, znaleziona ekstynkcja pomnożona przez 2,5 daje ilość białka w %o. W przypadku, gdy wskaźnik ekstynkcji przekracza 1,0, mocz najpierw rozcieńcza się 2, 4 lub nawet więcej.

Aby mieć jasny pogląd na ilość białek wydalanych z moczem, należy określić nie tylko ich stężenie w osobnej porcji moczu, ale także ich całkowitą dobową ilość. W tym celu należy zbierać mocz pacjenta przez 24 godziny, zmierzyć jego objętość w mililitrach i oznaczyć stężenie białka w porcji dobowego moczu w g%. Ilość białek wydalanych z moczem w ciągu 24 godzin określa się w zależności od dziennej ilości moczu w gramach.

Kliniczne znaczenie białka w moczu

Białkomocz został odkryty jako objaw diagnostyczny w 1770 roku przez Cotugno.

Do najważniejszych czynnościowych białkomoczu nerek u dzieci zalicza się:

1. Białkomocz fizjologiczny noworodka. Występuje u większości noworodków i nie ma niekorzystnego znaczenia. Można to wytłumaczyć słabym filtrem nerkowym, uszkodzeniem przy urodzeniu lub utratą płynów w pierwszych dniach życia. Białkomocz fizjologiczny zanika w 4-10 dobie po urodzeniu (później u wcześniaków). Ilość białka jest niewielka. Jest to albumina nukleinowa.

Objawem choroby wrodzonej może być albuminuria noworodkowa, która utrzymuje się przez długi czas.

2. Albuminuria udarowa. Są one spowodowane przekroczeniem progu normalnej drażliwości filtra nerkowego przez znaczne podrażnienia mechaniczne, termiczne, chemiczne, psychiczne i inne - utratą płynów u niemowląt (białkomocz odwodnieniowy), zimnymi kąpielami, obfitym pokarmem bogatym w białko (białkomocz pokarmowy), palpacja nerek (albuminuria palpacyjna), przepracowanie fizyczne, strach itp.

Albuminuria udarowa pojawia się łatwiej u dzieci we wczesnym wieku niż u starszych dzieci i dorosłych, ponieważ nerki niemowląt i małych dzieci są łatwiej podrażnione. Szczególnie często u niemowląt obserwuje się albuminurię odwodnieniową (zaburzenia karmienia, osłabienie płynów, zatrucie, biegunkę, wymioty).

Albuminuria udaru jest łagodna. Znikają natychmiast po wyeliminowaniu przyczyn je wywołujących. W osadzie czasami występują pojedyncze leukocyty, wałeczki i erytrocyty. Białkiem jest najczęściej albumina nukleinowa.

3. Białkomocz ortostatyczny. Ten stan jest typowy dla dzieci w wieku przedszkolnym i szkolnym. Występuje z powodu zaburzeń naczynioruchowych w dopływie krwi do nerek. Charakterystyczną cechą albuminurii ortostatycznej (stąd jej nazwa) jest to, że pojawia się ona tylko wtedy, gdy dziecko stoi, gdy kręgosłup znajduje się w pozycji lordotycznej. Kiedy leży, znika. Uwalniana jest albumina nukleotydowa. W wątpliwych przypadkach można zastosować eksperyment ortostatyczny, który polega na tym, że: wieczorem, na godzinę przed pójściem spać, dziecko opróżnia pęcherz; Rano, gdy wstaje z łóżka, ponownie oddaje mocz. Ten mocz nie zawiera białka. Następnie dziecko kładzie się na kolanach na 15-30 minut z kijem za plecami, pomiędzy zgiętymi łokciami obu rąk. Tworzy się pozycja lordotyczna, która prowadzi do uwolnienia białka, bez zmian w osadzie.

W przypadku albuminurii ortostatycznej można uwolnić 8-10 g białka dziennie.

Organiczne białkomocz nerkowy ma największe znaczenie kliniczne spośród wszystkich białkomoczu. Są spowodowane organicznymi chorobami nerek (zapalenie nerek, nerczyca, stwardnienie nerek). Białkomocz jest jednym z najważniejszych i najbardziej znanych objawów organicznej choroby nerek.

1. W ostrym i przewlekłym kłębuszkowym zapaleniu nerek białkomocz występuje regularnie. Ilość białka jest umiarkowana i nie ma związku między stopniem białkomoczu a ciężkością choroby. Wręcz przeciwnie, przewlekłe i cięższe zapalenie nerek często występuje z mniejszą ilością białka niż ostre zapalenie nerek. Po ostrym zapaleniu nerek, czasami przez długi czas (lata), w moczu wykrywane są niewielkie ilości białka, które nie mają znaczenia patologicznego („albuminuria resztkowa”). Nie należy zapominać, że może również wystąpić „zapalenie nerek bez białkomoczu”. Czasami białko występuje w jednej porcji moczu, ale nie w drugiej. Stosunek albumin do globulin w ostrym zapaleniu nerek jest niski, a w przewlekłym zapaleniu nerek – wyższy.

2. W przypadku stwardnienia nerek ilość białka w moczu jest bardzo mała; często stwierdza się postacie choroby bez białka w moczu.

3. Ze wszystkich chorób nerek nerczyca występuje z najcięższym białkomoczem.

4. W stanach zakaźnych i toksycznych dochodzi do tzw. białkomoczu gorączkowego i toksycznego. Są to ostre nerczyce, w których ilość białka jest niewielka. Do tej grupy zalicza się również białkomocz podczas drgawek (drgawki), nadczynność tarczycy, żółtaczkę, wgłobienie, zapalenie jelit, oparzenia, ciężką niedokrwistość itp. Albuminuria jest łagodna i szybko ustępuje (przejściowa albuminuria).

5. Kiedy krew w nerkach zatrzymuje się, dochodzi do tzw. albuminurii zastoinowej, charakterystycznej dla pacjentów kardiologicznych w fazie dekompensacji. Występuje również w przypadku wodobrzusza i guzów jamy brzusznej.

W gorączkowej, toksycznej i zastoinowej albuminurii szczególnie wyraźna jest zwiększona przepuszczalność filtra nerkowego. Według niektórych autorów wiele z tych białkomoczu występuje bez organicznego uszkodzenia miąższu nerek.

Albuminuria pozanerkowa są zwykle powodowane przez zanieczyszczenia białkowe (wydzieliny, rozkład komórek), które są wydzielane przez chore drogi moczowe i narządy płciowe. Albuminuria pozanerkowa występuje częściej z powodu zapalenia pęcherza moczowego (romocz), rzadziej z powodu zapalenia sromu i pochwy, kamieni i nowotworów dróg moczowych.

W przypadku albuminurii pozanerkowej w osadzie znajduje się duża liczba leukocytów i bakterii. Elementy nerkowe prawie nigdy nie są znajdowane. Ilość białka jest niewielka. Filtrowany lub odwirowany mocz zwykle nie daje pozytywnego wyniku na obecność białka.

U osób wracających do zdrowia po zapaleniu miedniczek albuminuria zanika po bakteriurii i ropomoczu.

Jako charakterystyczne zjawisko należy podkreślić, że we wczesnym dzieciństwie organiczne choroby nerek pojawiają się niezwykle rzadko, dlatego rzadko występuje także organiczna proteinuria. Wśród nich są głównie gorączkowe i toksyczne. W przeciwieństwie do organicznej proteinurii, albuminuria udarowa występuje bardzo często u dzieci we wczesnym wieku.

U starszych dzieci białkomocz organiczny częściej ma charakter czynnościowy. Ogólnie rzecz biorąc, wraz z wiekiem białkomocz czynnościowy występuje rzadziej, częściej zaś białkomocz organiczny.

Badania elektroforetyczne białek w moczu

Wszystkie metody oznaczania białka w moczu opierają się na koagulacji białek pod wpływem czynników chemicznych lub termicznych. Jeśli w moczu znajduje się białko, pojawia się zmętnienie, którego stopień zależy od ilości białka.

A) próbki jakości oznaczenie białka w moczu jest obowiązkowe.

1. Przetestuj kwasem azotowym– ostrożnie dodać do probówki równą ilość moczu zawierającą 1-2 ml 50% roztworu kwasu azotowego, starając się nie wstrząsać płynem. Jeśli w moczu obecne jest białko, na granicy obu płynów pojawia się biały pierścień, lepiej widoczny na czarnym tle.

2. Przetestuj z kwasem sulfasalicylowym– Do probówki wlewa się 4-5 ml moczu i dodaje 8-10 kropli odczynnika. Jeżeli w moczu znajduje się białko, w zależności od jego ilości może wystąpić zmętnienie lub kłaczki.

3. Test ekspresowy (sucha próbka diagnostyczna)– w badanym moczu zanurza się pasek bibułki wskaźnikowej Albufan tak, aby jednocześnie zwilżyć obie strefy wskaźnikowe (górna strefa służy do oznaczania pH, dolna strefa służy do oznaczania białka). Po 2-3 sekundach pasek umieszcza się na białej szklanej płytce. Oceny dokonuje się po 60 sekundach od zwilżenia paska moczem, korzystając ze skali barw wydrukowanej na piórniku z paskami wskaźnikowymi.

B) próbki ilościowe– przeprowadza się w tych porcjach moczu, w których w trakcie oznaczania jakościowego wykryto białko; oznaczenie przeprowadza się w warstwie supernatantu po odwirowaniu

Metoda Brandberga-Robertsa-Stolnikowa– Do probówki wlewa się 1-3 ml 50% roztworu kwasu azotowego i taką samą ilość moczu ostrożnie rozprowadza się wzdłuż ścianek. Czas rejestrowany jest na stoperze. Jeśli natychmiast lub przed upływem 2 minut po nałożeniu warstw utworzy się pierścień na granicy cieczy, mocz należy rozcieńczyć wodą. Następnie ponownie oznacza się białko w rozcieńczonym moczu. Rozcieńczanie przeprowadza się do pojawienia się białego pierścienia pomiędzy 2. i 3. minutą, gdy rozcieńczony mocz dodano do kwasu azotowego. Ilość białka określa się mnożąc 0,033 ppm przez stopień rozcieńczenia.

18. Technika pobierania wymazów na florę, gonokoki, rzęsistki, badanie cytologiczne, KPI.

Technika pobierania rozmazów na florę: pobiera się materiał z kanału szyjki macicy i cewki moczowej za pomocą specjalnego pędzelka pod kontrolą wzrokową. Otrzymaną próbkę natychmiast umieszcza się na szkiełku i rozciera.

Technika pobierania wymazów na Trichomonas: najpierw pobrać materiał poprzez zeskrobanie z błony śluzowej cewki moczowej (po wstępnym masażu przez 1 minutę spojenia łonowego) i tylnego sklepienia pochwy, następnie przetrzeć część pochwową szyjki macicy sterylnym wacikiem zwilżonym solą fizjologiczną roztworem, należy usunąć czop śluzowy i ostrożnie wprowadzić go do kanału szyjki macicy na głębokość nie większą niż 1,0-1,5 cm, wprowadzić sondę i pobrać zeskrobinę z błony śluzowej szyjki macicy.

Technika pobierania wymazów na gonokoki: materiał pobiera się z cewki moczowej, gruczołów Bartholina i przewodów przycewkowych po przetarciu ich wacikiem nasączonym solą fizjologiczną, pęsetą pochwową lub specjalną sondą. Materiał pobiera się z odbytnicy tępą łyżką. W przypadku przewlekłej i odrętwiającej rzeżączki przed badaniem przeprowadza się prowokację, aby zwiększyć prawdopodobieństwo identyfikacji patogenu.

Podczas menstruacji nie można pobierać materiału wacikiem.

Technika pobierania wymazów do badania cytologicznego: pobiera się wymaz z powierzchni szyjki macicy, pochwy i sromu za pomocą szpatułki, z szyjki macicy za pomocą endoszczoteczki. Materiał nakłada się cienką warstwą na specjalnie obrobione odtłuszczone szkło i traktuje specjalną kompozycją, aby zapobiec wysychaniu komórek. Preparaty barwi się metodą Papanicolaou (tzw. rozmaz Pap) i bada pod mikroskopem.

Indeks kariopiknotyczny– odsetek komórek powierzchniowych z jądrami pyknotycznymi w stosunku do komórek z jądrami pęcherzykowymi (niepyknotycznymi). CPI na początku fazy folikularnej cyklu miesiączkowego wynosi 25-30%, do czasu owulacji 60-70%, w fazie lutealnej spada do 25%.

Skład miejsca pracy do oznaczania białka w moczu obejmuje następujące elementy:

1. Probówki chemiczne, probówki do aglutynacji.
2. Zestaw pipet z podziałką.
3. Pipety z wąskim, wyciąganym końcem.
4. Lampy alkoholowe lub palnik gazowy.
5. Czarny papier.
6. Lodowaty kwas octowy.
7. Kwas sulfosalicylowy.
8. Stężony kwas azotowy.
9. Woda destylowana.

Metody oznaczania białka w moczu

Wszystkie metody stosowane do jakościowego oznaczania białka w moczu opierają się na koagulacji białek. Koagulacja białek objawia się różnym stopniem zmętnienia (od opalescencji do silnego zmętnienia) lub utratą płatków.

Jakościowe oznaczenie białka w moczu można przeprowadzić na jeden z następujących sposobów:

1. wrzenie z 10% roztworem kwasu octowego;
2. reakcja z 20% roztworem kwasu sulfosalicylowego;
3. reakcja z 50% roztworem kwasu azotowego (test Gellera);
4. reakcja z 1% roztworem kwasu azotowego w nasyconym roztworze soli kuchennej (zmodyfikowany test Hellera według Larionowej).

Przed jakościowym oznaczeniem białka w moczu przeprowadza się następujące prace przygotowawcze:
1. Mętny mocz filtruje się przez filtr papierowy. Jeśli nie można uzyskać klarownego filtratu, przefiltruj go ponownie przez ten sam filtr lub zmieszaj mocz z niewielką ilością ziemi infuzorskiej lub talku, po czym poddaj go filtracji.
2. Jeśli mocz ma odczyn zasadowy, zakwasza się go 10% roztworem kwasu octowego do odczynu lekko kwaśnego pod kontrolą papierka lakmusowego lub uniwersalnego papierka wskaźnikowego.
3. Każdy z nich ma niską zawartość soli (jasnożółty lub jasnożółty mocz o niskim ciężarze właściwym).
Do próbki dodać kilka kropel nasyconego roztworu soli kuchennej, gdyż brak soli powoduje koagulację białek.
4. Stopień zmętnienia obserwuje się na czarnym tle. Jako tło stosuje się czarny karton lub czarny papier używany w fotografii. Uwzględnienie reakcji na czarnym tle pozwala zidentyfikować najmniejszy stopień zmętnienia.

Ponumerowane probówki umieszcza się w oddzielnym stojaku. Wykonują jedną z reakcji opisanych poniżej.

1. Testować poprzez gotowanie z 10% roztworem kwasu octowego. Do wykonania tego testu potrzebny jest 10% roztwór kwasu octowego, który przygotowuje się w następujący sposób: 10 ml lodowatego kwasu octowego umieszcza się w cylindrze i uzupełnia wodą destylowaną do kreski 100 ml.

Technika oznaczania białka. Do probówki chemicznej umieszcza się 10-12 ml przefiltrowanego moczu o odczynie lekko kwaśnym. Następnie górną część probówki z moczem ostrożnie podgrzewa się do wrzenia i dodaje się do niej 8-10 kropli 10% roztworu kwasu octowego. Probówkę z moczem ogląda się na czarnym tle w świetle przechodzącym. W obecności białka w moczu pojawia się zmętnienie o różnym stopniu (od opalizacji do silnego zmętnienia) lub pojawiają się płatki. Dolna część probówki, która nie jest podgrzewana, służy jako kontrola. Test ten wykrywa ilość białka począwszy od 0,015%o (%o - promille).

2. Reakcja z 20% roztworem kwasu sulfosalicylowego. 20% roztwór kwasu sulfosalicylowego przygotowuje się w następujący sposób: 20 g kwasu sulfosalicylowego rozpuszcza się w 70-80 ml wody destylowanej, przenosi do cylindra o pojemności 100 ml i uzupełnia wodą destylowaną do kreski. Przygotowany odczynnik przechowywany jest w ciemnym szklanym pojemniku.

Technika oznaczania białka. Do dwóch probówek o tej samej średnicy umieszcza się 2-3 ml przefiltrowanego moczu o odczynie słabo kwaśnym, do jednej z probówek dodaje się 3-4 krople 20% roztworu kwasu sulfosalicylowego, druga probówka służy jako kontrola. Jeżeli w probówce z odczynnikiem znajduje się białko, pojawia się zmętnienie lub wypadają płatki skoagulowanego białka. W rurce kontrolnej ciecz pozostaje klarowna. Kwas sulfosalicylowy wraz z białkiem osocza wytrąca albumozy (peptydy), które są produktem rozkładu białek. Aby wyjaśnić przyczynę zmętnienia moczu, probówkę z moczem podgrzewa się. Zwiększa się zmętnienie spowodowane tworzeniem się białek serwatkowych, natomiast zanika zmętnienie spowodowane obecnością albumozy. Ten test ma taką samą czułość jak poprzedni.

3. Reakcja z 50% roztworem kwasu azotowego (test Gellera). 50% roztwór kwasu azotowego przygotowuje się w następujący sposób: do 50 ml kwasu azotowego o ciężarze właściwym 1,2-1,4 dodać 50 ml wody destylowanej (rozcieńczenie 1:1).

Technika oznaczania białka. Do wąskiej małej probówki (błoto aglutynacyjne) wlewa się 1 ml 50% kwasu azotowego. 1 ml przefiltrowanego moczu testowego pobiera się do pipety z wąskim, przedłużonym końcem, nakłada na odczynnik warstwami i probówkę przenosi się do pozycji pionowej. Gdy białko jest obecne, na granicy faz cieczy pojawia się biały pierścień. Czas pojawienia się pierścienia i jego właściwości zależą od ilości białka: jeśli białka jest mało, pierścień nie pojawia się natychmiast, dlatego jego wygląd monitoruje się przez 2,5-3 minuty. Minimalna ilość białka określona tą metodą wynosi 0,033°/oo. Przy niższej zawartości białka w moczu pierścień nie tworzy się. Wyniki reakcji rejestruje się na czarnym tle w świetle przechodzącym.

4. Reakcja z 1% roztworem kwasu azotowego w nasyconym roztworze soli kuchennej - zmodyfikowany test Hellera (wg Larionowej). Do przeprowadzenia testu należy użyć 1% roztworu kwasu azotowego przygotowanego w nasyconym roztworze soli kuchennej (odczynnik Larionova). 35 g soli kuchennej rozpuszcza się w 100 ml wody destylowanej, roztwór sączy się, 99 ml przygotowanego nasyconego roztworu soli kuchennej dodaje się do 1 ml stężonego kwasu azotowego o ciężarze właściwym 1,2-1,4.

Technika oznaczania białka analogicznie jak w reakcji z 50% roztworem kwasu azotowego (próba Gellera), ale zamiast 1 ml 50% roztworu kwasu azotowego do probówki wlewa się 1 ml odczynnika Larionova i nakłada się 1 ml moczu To. Pojawienie się białego pierścienia na styku cieczy wskazuje na obecność białka w badanym moczu. Test Larionowej jest tak samo czuły jak test Hellera.

5. Test kolorymetryczny (suchy) do jakościowego oznaczania białka. Kolorymetryczny (suchy) test do jakościowego oznaczania białka w moczu opiera się na wpływie białka na barwę wskaźnika w roztworze buforowym.

Technika oznaczania białka. Kawałek papierka wskaźnikowego przeznaczonego do oznaczania białka zanurza się na krótki czas w moczu. Test uznaje się za pozytywny, jeśli kartka papieru zmieni kolor na niebiesko-zielony.

Ilościowe oznaczanie białka w moczu

Ilościowe oznaczanie białka w moczu opiera się na fakcie, że gdy mocz zawierający białko zostanie pokryty 50% roztworem kwasu azotowego lub odczynnikiem Larionova, na granicy obu cieczy powstanie biały pierścień, a jeśli pojawi się przezroczysty biały pierścień o 3 minuty, wówczas zawartość białka wynosi 0,033% lub 33 mg w 1000 ml moczu. Pojawienie się pierścienia wcześniej niż 3 minuty wskazuje na wyższą zawartość białka w moczu.
Przy oznaczaniu ilościowym białka w moczu należy przestrzegać następujących zasad:

1. Ilościowe oznaczanie białka przeprowadza się tylko w tych porcjach moczu, w których zostało ono wykryte jakościowo.
2. Oznaczenie przeprowadza się na podstawie dokładnie przefiltrowanego moczu.
3. Ściśle przestrzegana jest technika nakładania warstw moczu testowego 50% roztworem kwasu azotowego lub odczynnika Larionova w stosunku odczynnika do moczu (1:1).
4. Czas pojawienia się pierścienia określa się za pomocą stopera: przy ostatecznym obliczeniu ilości białka uwzględnia się czas nawarstwiania się moczu na kwasie azotowym, który wynosi 15 sekund.
5. Rozcieńczanie moczu przeprowadza się w oparciu o właściwości pierścienia. W takim przypadku każde kolejne rozcieńczenie moczu przygotowywane jest z poprzedniego.
6. Pierścienie są oznaczone na czarnym tle.

Najbardziej powszechne są dwie metody ilościowego oznaczania białka w moczu: metoda Robertsa-Stolnikowa-Brandberga oraz metoda S. L. Ehrlicha i A. Ya Althauzena.

1. Metoda Robertsa-Stolnikowa-Brandberga. Według tej metody ilość białka w moczu określa się poprzez jego rozcieńczenie do momentu, w którym po kolejnym nałożeniu na mocz 50% roztworu kwasu azotowego lub odczynnika Lariona pierścień pojawi się dokładnie po 3 minutach. Ilość białka oblicza się mnożąc 0,033% przez stopień rozcieńczenia moczu. Otrzymany wynik wyraża ilość białka w miligramach na 1000 ml moczu, czyli w promilach (%o).
2. Metoda S. L. Ehrlicha i A. Ya Althauzena. W stojaku umieszcza się serię probówek do aglutynacji, do których najpierw wlewa się 1 ml 50% roztworu kwasu azotowego lub odczynnika Larionova. Mocz do badania pobiera się oddzielną, czystą, suchą pipetą z wąską, wyciągniętą końcówką i nakłada na odczynnik, po czym włącza się stoper. Czas pojawienia się pierścienia monitoruje się umieszczając probówkę na czarnym tle. Gdy pojawi się pierścień, stoper zostanie wyłączony.

Podczas układania moczu warstwowo, w zależności od ilości białka, może pojawić się zwarty, szeroki lub nitkowaty pierścień. Zwarty, szeroki pierścień pojawia się natychmiast po nałożeniu moczu na odczynnik. Nitkowaty pierścień może pojawić się natychmiast, przed upływem jednej minuty lub w ciągu jednej do czterech minut.

Jeśli w ciągu jednej do 4 minut pojawi się nitkowaty pierścień, nie ma potrzeby rozcieńczania moczu!
Aby obliczyć ilość białka w tym przypadku wystarczy skorzystać z zaproponowanego przez autorów planu tabeli (tab. 1).

Przykład 1. Gdy na odczynnik nałożono warstwę moczu, w ciągu 2 minut utworzył się nitkowaty pierścień. Jeżeli pierścień utworzyłby się w ciągu 3 minut, ilość białka wynosiłaby 0,033%.

W tym przypadku pierścień powstał wcześniej. Odpowiednia korekta, zgodnie z tabelą planu, dla czasu 2 minut wynosi 1+1/8. Oznacza to, że białka w danej porcji moczu będzie 1+1/8 razy więcej niż 0,033°/oo, czyli 0,033%o X(1+1/8) = 0,037°/oo.

Jeżeli w ciągu 1 minuty, tj. po 40-60 sekundach pojawi się nitkowaty pierścień, należy wykonać jedno 1,5-krotne rozcieńczenie moczu (2 części moczu + 1 część wody), a następnie ponownie nałożyć rozcieńczony mocz na odczynnik i zanotować wygląd pierścienia. Przy obliczaniu wyników bierze się pod uwagę, że mocz został rozcieńczony 1,5 razy.

Przykład 2. Po nałożeniu warstw moczu rozcieńczonego 1,5 razy, w ciągu 2 minut pojawił się nitkowaty pierścień. Gdyby pierścień pojawił się po 3 minutach, zawartość białka wynosiłaby 0,033%. Odpowiednia poprawka zgodnie z tabelą planu dla czasu 2 minut wynosi 1+1/8. Białko w moczu zawiera 0,033%oX1,5X(1+1/8) = 0,056%o.

Jeśli natychmiast pojawi się nitkowaty pierścień, mocz rozcieńcza się 2 razy (1 część moczu + 1 część wody). Rozcieńczony mocz ponownie nałożono warstwami na odczynnik i po 1 minucie odnotowano pojawienie się pierścienia.

Przykład 3. Po nałożeniu na odczynnik 2-krotnie rozcieńczonego moczu, po 1 minucie i 15 sekundach pojawił się nitkowaty pierścień. Wtedy ilość białka w badanym moczu, analogicznie do poprzednich obliczeń, będzie równa
0,033%оХ2Х(1+3/8) = 0,091%.
Jeśli pojawi się szeroki pierścień, mocz rozcieńcza się 4 razy (1 część moczu + 3 części wody).
Po nałożeniu kolejnych warstw rozcieńczonego moczu przed lub po minucie może utworzyć się nitkowaty pierścień. W takich przypadkach ilość białka oblicza się analogicznie jak w poprzednich przykładach, tj. 0,033% o mnoży się przez stopień rozcieńczenia i odpowiednią poprawkę.

Przykład 1. Po 4-krotnym rozcieńczeniu moczu pierścień pojawił się natychmiast. Mocz rozcieńcza się 2 razy. Po nałożeniu warstw moczu rozcieńczonego 8 razy (4X2) w ciągu 1,5 minuty utworzył się nitkowaty pierścień. W tym przypadku ilość białka wynosi 0,033%oX8X1,25 = 0,33%o itd.
Kiedy pojawi się zwarty pierścień, mocz rozcieńcza się 8 razy (1 część moczu + 7 części wody). Kiedy rozcieńczony mocz zostanie następnie nałożony na odczynnik, może powstać zwarty, szeroki lub nitkowaty pierścień.

Przykład 2. Kiedy mocz nałożono na kwas azotowy, natychmiast utworzył się zwarty pierścień. Mocz rozcieńcza się 8 razy (1 część moczu + 7 części wody) i ponownie nakłada na siebie warstwy. To ponownie dało zwarty pierścień. Następnie mocz rozcieńcza się jeszcze 8 razy (w tym celu należy pobrać 1 część rozcieńczonego moczu do cylindra lub probówki i dodać do niego 7 części wody). Po kolejnej warstwie rozcieńczonego moczu natychmiast utworzył się nitkowaty pierścień. Mocz rozcieńcza się 2 razy (1 część moczu + 1 część wody). Po kolejnym nałożeniu rozcieńczonego moczu w ciągu 2 minut utworzył się nitkowaty pierścień. Ilość białka w danej porcji moczu oblicza się następująco: 0,033.%oX8X8X2X(1+1/8) = 4,8%o.

Oprócz tabeli planu znajduje się tabela z obliczonymi wartościami białka (Tabela 2). Jeśli mocz nie jest rozcieńczony, ilość białka znajduje się w kolumnie „Cały, nierozcieńczony mocz”. Rozcieńczając mocz całkowitą liczbę razy (8,4,2), skorzystaj z tabeli. 1. Przy 1,5-krotnym rozcieńczaniu moczu skorzystaj z tabeli. 2.

Technika wykorzystania tabeli do określenia zawartości białka w moczu

W odpowiednich kolumnach tabeli wskaż czas pojawienia się pierścienia i stopień rozcieńczenia moczu.
Liczba znajdująca się na przecięciu poziomej i pionowej linii tych dwóch wskaźników wskazuje ilość białka w badanym moczu (%o).

Możliwe jest, że przy dodatnim teście jakościowym na obecność białka pierścień nie utworzy się po nałożeniu warstw 50% roztworu kwasu azotowego. Oznacza to, że w moczu znajduje się mniej niż 0,033% białka. W takich przypadkach ilość białka w postaci analitycznej określa się terminem „ślady”.

Jeśli białko jest oznaczane ilościowo, w formularzu analizy moczu odnotowuje się zawartość białka w promilu, na przykład „białko - 0,66% o”.

Oprócz ilościowego oznaczenia białka w oddzielnej porcji moczu obliczana jest jego dzienna ilość w gramach. W tym celu codziennie pobiera się mocz, mierzy się jego ilość i określa zawartość białka w promilach. Następnie dokonuje się obliczeń. Przykładowo dzienna ilość moczu wynosi 1800 ml, białka 7°/oo. Oznacza to, że dzienna ilość moczu zawiera białko: 1,8X7 = 12,6 g.

Zasada metody

Intensywność zmętnienia podczas koagulacji białka kwasem sulfosalicylowym jest proporcjonalna do jego stężenia.

Niezbędne odczynniki

I. 3% roztwór kwasu sulfosalicylowego.

II. 0,9% roztwór chlorku sodu.

III. Roztwór wzorcowy albuminy- 1% roztwór (1 ml roztworu zawierającego 10 mg albuminy): 1 g liofilizowanej albuminy (z surowicy ludzkiej lub bydlęcej) rozpuszcza się w małej ilości 0,9% roztworu chlorku sodu w kolbie o pojemności 100 ml, a następnie rozcieńcza do kreski to samo rozwiązanie. Odczynnik stabilizuje się dodając 1 ml 5% roztworu azydku sodu (NaN3). Odczynnik przechowywany w lodówce zachowuje trwałość przez 2 miesiące.

Specjalny sprzęt- kolorymetr fotoelektryczny.

Postęp badania

Do probówki dodać 1,25 ml przefiltrowanego moczu, dodać do 5 ml 3% roztworu kwasu sulfosalicylowego i wymieszać. Po 5 minutach mierzy się je fotoelektrokolorymetrem przy długości fali 590-650 nm (filtr pomarańczowy lub czerwony) względem kontroli w kuwecie o długości drogi optycznej 5 mm. Kontrolę stanowi probówka, w której do 1,25 ml przefiltrowanego moczu dodano 0,9% roztwór chlorku sodu do objętości 5 ml. Obliczenia przeprowadza się zgodnie z wykresem kalibracyjnym, do konstrukcji którego przygotowuje się rozcieńczenia z roztworu wzorcowego, jak wskazano w tabeli.

Przygotowanie rozcieńczeń do skonstruowania wykresu kalibracyjnego

Z każdego otrzymanego roztworu pobiera się 1,25 ml i traktuje jako próbki doświadczalne.

Zależność liniowa przy konstruowaniu wykresu kalibracyjnego utrzymuje się do 1 g/l. Przy wyższych stężeniach próbkę należy rozcieńczyć i uwzględnić to rozcieńczenie w obliczeniach.

Wyniki fałszywie dodatnie można uzyskać, jeśli w moczu obecne są środki kontrastowe zawierające jod organiczny. Dlatego też testu nie można stosować u osób przyjmujących preparaty jodu, fałszywie dodatni wynik może być także skutkiem przyjmowania leków sulfonamidowych, dużych dawek penicyliny oraz wysokiego stężenia kwasu moczowego w moczu.